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PCR實驗室

臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗

，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎

、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段

。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設(shè)越來越得到重視，因為它對檢測結(jié)果的可靠性

、準確性和安全性起到至關(guān)重要的作用

。

一、設(shè)計要求

、概述

臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗

，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎

、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段

。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設(shè)越來越得到重視，因為它對檢測結(jié)果的可靠性

、準確性和安全性起到至關(guān)重要的作用

。

2、PCR實驗室平面布局

臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)

、標本制備區(qū)

、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)

。為避免交叉污染

，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)

。

各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行

。

PCR實驗室平面布置示意圖如圖1所示。

詳情介紹

、實驗室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求

，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式

。同時

，要嚴格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求

。

3.1

、試劑貯存和準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備

。試劑和用于標本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)

，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑

。

對與氣流壓力的控制

，本區(qū)并沒有嚴格的要求。

3.2

、標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存

、核酸(RNA、DNA)提取

、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成

。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染

。另外

，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動

。

3.3

、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外

，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行

。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管

，因此巢式擴增有較高的污染危險性

，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓

，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出

。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動

。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行

。

3.4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定

。如使用全自動封閉分析儀器檢測

，此區(qū)域可不設(shè)。

本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源

，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓

，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。

、污染的預(yù)防與控制

PCR實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染

。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產(chǎn)物的污染

；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染

，實驗就必須停止

，直到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢

，需重新進行實驗

。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力

。因此要避免污染

，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除

。

4.1

、工作區(qū)域的嚴格劃分

（1）、各個實驗區(qū)域設(shè)置合理

；

（2）

、各個實驗區(qū)域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設(shè)備物品

、試劑等發(fā)生混淆

。

4.2、合理的系統(tǒng)設(shè)置

（1）

、合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置

，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；

（2）

、嚴格的氣流壓力控制

，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

4.3

、規(guī)范的操作

（1）

、臨床基因擴增檢驗實驗室的技術(shù)人員必須進行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作

；

（2）

、在實驗操作過程中，操作者必須戴手套

，并經(jīng)常更換

。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施

；

（3）

、清潔工作及時、正確

。實驗工作結(jié)束后

，必須立即對本區(qū)進行清潔

。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設(shè)備還應(yīng)進行高壓消毒處理

。

4.4

、嚴格的管理

（1）、嚴格控制進出實驗室的人員

。與實驗無關(guān)的人員不得隨意進出實驗室

，有條件的情況下要設(shè)置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門；

（2）

、在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服（如不同顏色）

，當(dāng)工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；

（3）

、盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性

。

（4）、擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源

，廢液不能在實驗室中傾倒

，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理

，如焚燒等

；

（5）、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)

，應(yīng)特別注意實驗人員的安全防護

。

4.5、完備的實驗室配套設(shè)施完備的實驗室配套設(shè)施是保證實驗工作的必要條件

，應(yīng)根據(jù)各個實驗室實驗內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器

，如超凈工作臺、離心機

、加樣器等

。

二、設(shè)計圖紙

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